氧化型谷胱甘肽（GSSG）测定试剂盒

简介： 氧化型谷胱甘肽(GSSG)是谷胱甘肽(GSH)的氧化形式，又称为二硫谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化面成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。   试剂盒组分: 试剂名称 规格：96T 保存条件 试剂一 液体×1瓶 2-8℃保存 试剂二 液体×3瓶 2-8℃保存 试剂三 液体×1瓶 2-8℃保存 试剂四 液体×1瓶 2-8℃保存 试剂五 粉剂×1瓶 2-8℃保存 试剂六 液体×1瓶 2-8℃保存 标准品 液体×1瓶 2-8℃保存 酶标板 96T 室温 本试剂盒可用于检测细胞、组织、血浆、血清、红血球、等样品。   样本处理: 1. 血清样品:将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1,000×g 离心15分钟，取上清即可，将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。 2. 血浆样品:用 EDTA或肝素钠抗凝管采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 4℃冰箱，1,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。 3. 组织匀浆: A、在预冷 PBS(0.01mol/L， pH=7.0-7.2)中清洗去除血液，低温切割标本后，准确称取组织重量。 B、按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质PBS。用手工或匀浆器将标本充分匀浆。 C、3000 ×g离心15分钟，仔细收集匀浆上清，弃沉淀，（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），≤-20℃以下保存。 4. 细胞裂解液:在分析试验之前，细胞需利用以下方法处理: A、贴壁细胞应该用冷 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，于 1,000×g 离心 5 分钟后收集，(悬浮细胞通过离心直接收集)，将收集到的细胞用冷 PBS 洗3次。 B、用 PBS 稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过超声破碎或反复冻融方式，以使细胞破坏并放出细胞内成份。3000 ×g离心15分钟，仔细收集上清，≤-20℃冷冻保存。 5. 细胞培养上清或其它生物体液标本:请 3,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。   二、检测步骤： 1 、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm, 分光光度计蒸馏水调零。 2、试剂二:有毒易挥发试剂，涉及该试剂的步骤建议在通风橱内操作。 3 、试剂三放置37℃，水浴保温30min。 4、试剂五:临用前加入 2.5 mL 蒸馏水，溶解后-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。 5、试剂六工作液:先将试剂六内液体离心至底部，后用移液枪吹打混匀使用。临用前根据样本数量按照试剂六: 蒸馏水=1uL:20uL(21uL，约10T)的比例配制备用，现用现配。 6、标准品：10mg氧化型谷胱甘肽。临用前加入1m蒸馏水，充分溶解，浓度为10mg/mL。 7、标准品稀释:吸取10mg/mL标准品，用蒸馏水稀释至 125ug/mL、62.5ug/mL、31.25ug/mL、15.625ug/mL、      7.8125ug/mL、3.90625ug/mL. 1、在EP管按下表步骤加样：   序号 标准品体积（ul） 蒸馏水体积（ul） 稀释后浓度（ug/mL） 1 100 900 1000 2 125 875 125 3 100 100 62.5 4 100 100 31.25 5 100 100 15.625 6 100 100 7.8125 7 100 100 3.90625   2、操作步骤：（在微量玻璃比色皿/1.5ml的EP管内加入下列试剂，勿用96孔板加样。）   试剂名称（ul） 测定管 标准管 空白管 样本 20     标准品   20   蒸馏水     20 试剂二 1 1 1 37℃ 孵育 30 分钟后，加入下列试剂 试剂三 140 140 140 试剂四 20 20 20 试剂五 20 20 20 试剂六工作液 2 2 2 加入试剂六工作液的同时开始计时，迅速混匀(若使用96孔板需快速转移至板中)，于 412nm 处测定 30s和150s的吸光值，分别记为 A1测定、A1标准，A1空白和A2测定、A2 标准、A2 空白。 计算：△A 测定=A2 测定-A1测定，△A 标准=A2标准-A1标准，△空白=A2空白-A1空白。空白管和标准曲线只需做1-2次。 注意：1.如果样本量过多，可将试剂三与试剂六工作液按照比例混匀配成工作液，在最后一步加入，加入工作液即开始计时。用多少配多少。 2.试剂二对 96 孔板有腐蚀性,所以第一步 37℃孵育勿加到 96孔板中,可统一加到 EP 管混匀后，每管吸取200ul转移至96孔板后进行测定。   三、GSSG含量计算： 1、绘制标准曲线: 以标准管的浓度(μg/mL)为横坐标x，以(ΔA标准-ΔA空白)为纵坐标 y，绘制标准曲线。根据标准曲线。将(A测定-ΔA空白)带入公式计算样本浓度(μg/mL)。   2、GSSG 含量计算: (1)按蛋白浓度计算:  GSSG含量(μg/mg prot) =XxV样÷(V样xCpr) = X÷Cpr (2)按样本质量计算:  GSSG含量(μg/g质量) =XxV样÷(V样÷V样总xW) = X÷W (3)按细胞/细菌数量计算:  GSSG含量(μg/10^cell) =XxV÷(V样÷V样总xN) = X÷N (4)按液体体积计算:  GSSG含量(μg/mL) =2x   V样总:上清液总体积，1mL;      V样:加入反应体系中上清液体积，20L=0.02mL;    W:样本质量，g:                Cpr:上清液蛋白质浓度，mg/mL;    N:细胞/细菌数量，以10计;      2:血浆(血细胞)稀释一倍。   注意事项： 1、若不确定样本中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。 2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样云量或者稀释样本后再进行测定。 3、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

灵敏度定义为可与零标准品区分的最低检测浓度（LOD），通常按平均值 + 2 倍标准差计算。 标准曲线、CV、回收率和线性范围需以该货号说明书或对应批次质检数据为准。