还原型谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒

简介： 谷胱甘肽是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成的天然三肽，是一种含巯基(-SH)的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。   试剂盒组分: 试剂名称 规格：96T 保存条件 试剂一 液体×3瓶 2-8℃保存 试剂二 液体×1瓶 2-8℃保存 试剂三 液体×1瓶 2-8℃保存 标准品 粉剂×1瓶 2-8℃保存 酶标板 96T   本试剂盒可用于检测细胞、组织、血浆、血清、红血球、等样品。     样本处理: 1. 血清样品:将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1,000×g 离心15分钟，取上清即可，将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。 2. 血浆样品:用 EDTA或肝素钠抗凝管采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 4℃冰箱，1,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。 3. 组织匀浆: A、在预冷 PBS(0.01mol/L， pH=7.0-7.2)中清洗去除血液，低温切割标本后，准确称取组织重量。 B、按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质PBS。用手工或匀浆器将标本充分匀浆。 C、3000 ×g离心15分钟，仔细收集匀浆上清，弃沉淀，（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），≤-20℃以下保存。 4. 细胞裂解液:在分析试验之前，细胞需利用以下方法处理: A、贴壁细胞应该用冷 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，于 1,000×g 离心 5 分钟后收集，(悬浮细胞通过离心直接收集)，将收集到的细胞用冷 PBS 洗3次。 B、用 PBS 稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过超声破碎或反复冻融方式，以使细胞破坏并放出细胞内成份。3000 ×g离心15分钟，仔细收集上清，≤-20℃冷冻保存。 5. 细胞培养上清或其它生物体液标本:请 3,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。   二、检测步骤： 1 、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm, 分光光度计蒸馏水调零。 2 、标准品：10mg还原型谷胱甘肽。临用前加入1m蒸馏水，充分溶解，浓度为10mg/mL。 3 、标准品稀释:吸取10mg/mL标准品，用蒸馏水稀释至 300ug/mL、200ug/mL、100ug/mL、50ug/mL、25ug/mL. 1、在EP管按下表步骤加样：   序号 标准品体积（ul） 蒸馏水体积（ul） 稀释后浓度（ug/mL） 1 30 970 300 2 500 250 200 3 200 200 100 4 200 200 50 5 200 200 25   2、操作步骤：（在1.5ml的EP管/96孔板加样内加入下列试剂。）   试剂名称（ul） 测定管 标准管 空白管 样本 20     标准品   20   蒸馏水     20 试剂二 140 140 140 试剂三 40 40 40 混匀后常温静置 2min 后分别在412nm处测定，测定管、标准管和空白管的吸光度，分别记为A测定、A标准和A空白，计算ΔA=A 测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白。标准曲线和空白管只需做1-2次。   三、计算方法： 1、标准曲线的绘制 据标准管的浓度(x，μg/mL)和吸光度ΔA 标准(y，ΔA标准)，建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA(y,ΔA)带入公式计算样本浓度(x，μg/mL)。   2、GSSG 含量计算: (1)按蛋白浓度计算:  GSH含量(μg/mg prot) =XxV样÷(V样xCpr) = X÷Cpr (2)按样本质量计算:  GSH含量(μg/g质量) =XxV样÷(V样÷V样总xW) = X÷W (3)按细胞/细菌数量计算:  GSH含量(μg/10^cell) =XxV÷(V样÷V样总xN) = X÷N (4)按液体体积计算:  GSH含量(μg/mL) =2x   V样总:上清液总体积，1mL;      V样:加入反应体系中上清液体积，20L=0.02mL;    W:样本质量，g:                Cpr:上清液蛋白质浓度，mg/mL;    N:细胞/细菌数量，以10计;      2:血浆(血细胞)稀释一倍。   注意事项： 1、若不确定样本中 GSH 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。 2、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样云量或者稀释样本后再进行测定。 3、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取组织。

灵敏度定义为可与零标准品区分的最低检测浓度（LOD），通常按平均值 + 2 倍标准差计算。 标准曲线、CV、回收率和线性范围需以该货号说明书或对应批次质检数据为准。